ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 24.04.2024
Просмотров: 972
Скачиваний: 2
СОДЕРЖАНИЕ
Министерство сельского хозяйства
Бактериологическая диагностика
1.2. Техника безопасности при работе в ветеринарной лаборатории
1.3. Общая схема проведения бактериологической диагностики
1.4. Правила взятия, консервирования и транспортировки патологического материала
Сопроводительное письмо на патологический материал
Задания для самостоятельной работы
2.1. Устройство оптического микроскопа.
2.2. Виды микроскопии и их назначение
3.1. Техника приготовления препаратов для микроскопии
3.2. Бактериологические краски
3.3. Простой метод окрашивания препарата для микроскопии
Задания для самостоятельной работы
Вопросы для самоподготовки и контроля знаний
Тема 4. Сложные (дифференциальные) методы окрашивания бактерий (4.1). Окраска по Граму (4.2)
4.1. Сложные (дифференциальные) методы окрашивания бактерий
Задания для самостоятельной работы
Тема 5. Сложные (дифференциальные) методы окрашивания бактерий: окраска спор (5.1) и капсул (5.2)
Тема 6. Назначение и классификация питательных сред для бактерий (6.1) и их приготовление (6.2)
6.1. Назначение и классификация питательных сред
Классификация питательных сред
6. 2. Приготовление питательных сред
Тема 7. Стерилизация. Методы: физические (7.1), химические (7.2), механические (7.3)
8.1. Техника посевов бактерий на питательные среды
8.2. Методы культивирования бактерий
8.3. Методы выделения чистых культур бактерий
Тема 9. Культуральные свойства бактерий на плотных (9.1) и в жидких (9.2) питательных средах
9.1. Культуральные свойства бактерий на плотных питательных средах
9.2. Культуральные свойства бактерий в жидких питательных средах
Тема 10. Ферментативные (биохимические) свойства бактерий
1. Определение ферментации углеводов
2. Определение протеолитических свойств
3. Определение редуцирующей (восстанавливающей) способности
11.1. Методы серийных разведений
Критерии оценки чувствительности стафилококков к пенициллину
11.2. Метод диффузии в агар (метод бумажных дисков)
Тема 12. Исследование бактерий на подвижность
В. Биологические методы исследований
13.1. Методы заражения лабораторных животных
13.2. Определение вирулентности микробов
13.3. Бактериологическое исследование трупа
Тема 14. Культивирование анаэробных микроорганизмов
Тема 15. Методы изучения микроскопических грибов и ак-тиномицетов
Тема 16. Методы изучения риккетсий (16.1), хламидий (16.2) и микоплазм (16.3)
16.1. Методы изучения риккетсий
16.2. Методы изучения хламидий
16.3. Методы изучения микоплазм
Раздел II. Основы санитарной микробиологии
Тема 17. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха (17.1) и почвы (17.2)
17.2. Санитарно-микробиологическое исследование почвы
Санитарно-бактериологические показатели почвы
Тема 18. Санитарно-микробиологическое исследование воды
19.1. Методы количественного определения микробов в исследуемых объектах
19.2. Санитарно-микробиологическое исследование мяса
Тема 20. Санитарно-микробиологическое исследование молока (20.1) и кисломолочных продуктов (20.2)
Классификация молока по редуктазе
Показатели бактериальной чистоты питьевого молока
20.2. Санитарно-микробиологическое исследование кисломолочных продуктов
Раздел III. Серологическая диагностика инфекционных болезней сельскохозяйственных животных
21.1. Реакция кольцепреципитации
21.2. Реакция диск-преципитации
21.3. Реакция диффузионной преципитации (рдп)
22.1. Постановка реакции агглютинации классическим (пробирочным) методом
22.2. Другие модификации постановки реакции. Кольцевая реакция с молоком (кр)
Тема 23. Реакция связывания комплемента (рск)
Задания для самостоятельной работы (для трех занятий)
Тема 24. Методы люминесцентной микроскопии
Тема 25. Иммуноферментный метод (ифм) диагностики инфекционных болезней
Тема 26. Использование в микробиологии полимеразной цепной реакции (пцр)
Тема 27. Использование в микробиологии днк-зондов
Раздел IV. Специальная (частная) микробиология
Тема 28. Патогенные стафилококки.
Тема 29. Патогенные стрептококки
Тема 30. Возбудители эшерихиозов
Тема 31. Возбудители сальмонеллезов
Тема 32. Возбудитель листериоза
Тема 33. Возбудитель рожи свиней
Тема 34. Возбудитель антропозоонозной чумы
Тема 35. Возбудители гемофилезов
Тема 36. Возбудитель пастереллеза
Тема 37. Возбудитель туляремии
Тема 38. Возбудитель бруцеллеза
Тема 39. Возбудитель сибирской язвы
40.1. Возбудитель эмфизематозного карбункула (эмкара)
40.2. Возбудители злокачественного отека
40.3. Возбудитель брадзота овец
40.4. Возбудитель инфекционной анаэробной энтеротоксемии
41.3. Возбудитель некробактериоза (фузобактериоза)
41.4. Возбудитель копытной гнили
Тема 42. Возбудители туберкулеза (42.1) и паратуберкулеза (42.2)
42.2. Возбудитель паратуберкулеза
Тема 43. Возбудитель актиномикоза
Тема 45. Возбудитель лептоспироза
Тема 46. Возбудитель кампилобактериоза (вибриоза)
Тема 47. Возбудитель дизентерии свиней
Тема 48. Возбудители микоплазмозов
Тема 49. Возбудители риккетсиозов
Тема 50. Возбудители хламидиозов
Тема 52. Возбудители микотоксикозов
Задания для програмированного контроля знаний студентов по частной ветеринарной микробиологии
Ответы на задания для программированного контроля по разделу «Частная микробиология»
Тема 25. Иммуноферментный метод (ифм) диагностики инфекционных болезней
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Дать общее представление о сущности иммуноферментного метода. Ознакомить с компонентами и оборудованием для проведения этого метода. Провести определение антигена с помощью ИФМ.
МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ для выполнения твердофазного иммуноферментного метода. Иммунологический планшет, специфические сыворотка или иммуноглобулины, термостат, фосфатный буфер рН 7,2-7,4 с твин-20, специфический антиген (для контроля – неспецифический антиген), шприц-дозатор, пероксидазный антивидовой конъюгат (антивидовая меченая сыворотка), субстратная смесь (индикатор ортофенилдиамин с 3%-ным раствором перекиси водорода).
Иммуноферментный метод основан на взаимодействии антигена и антитела, где в качестве метки в конъюгате (комплекс антитела или антигена с ферментом) используется фермент пероксидаза или другая соответствующая к ним субстратная смесь (5-аминосалициловая кислота и перекись водорода или ортафенилендиамин и перекись водорода). По чувствительности этот метод в 100 и более раз превышает РНГА, РДП и др. Предел чувствительности иммуноферментного метода достигает 1-10 нг/мл специфического белка.
Иммуноферментный метод используется для выявления и идентификации микроорганизмов и антител к ним. Различают две разновидности иммуноферментного метода: гомогенный и гетерогенный.
Гетерогенный (в литературе он описан под названием иммуносорбентного - ELISA-теста и РЭМА - реакции энзиммеченых антител (или антигенов), адсорбированных на поверхности водонерастворимых полимеразных материалов. При гомогенном иммуноферментном методе не используется твердая фаза.
Гомогенный иммуноферментный метод в основном используется для определения низкомолекулярных антигенов (гормонов, лекарственных препаратов).
Основные компоненты, необходимые для выполнения твердофазного иммуноферментного метода:
1. Специфические иммуноглобулины (выделяются из гипериммунной сыворотки осаждением сульфатом аммония с последующей очисткой).
2. Антивидовые глобулины (выделяются из антивидовых сывороток осаждением сульфатом аммония с последующей очисткой).
3. Белок А (выделяют из золотистого стафилококка) или бычий сывороточный альбумин.
4. Антиген (готовят из органов зараженных животных). Заведомо положительные или отрицательные антигены.
5. Фермент пероксидаза (выделяют из хрена).
6. Конъюгаты (пероксидаза, связанная с антителами или антигеном методом периодатного окисления).
7. Субстратная смесь (5-аминосалициловая кислота и перекись водорода или ортофенилендиамин и перекись водорода).
8. Детергент (поверхностноактивные вещества: твин-20, 80, трилон Х-100, сорбиталь с-20).
9. Иммунологический планшет (планшет из прозрачного полистирола).
10. Шприц-дозатор (для разлива ингредиентов реакции).
На биофабриках и в лабораториях научно-исследовательских институтов готовят диагностические наборы.
Существуют прямой и непрямой методы постановки этой реакции. На практике в основном используется непрямой метод.
Методика постановки иммуноферментного метода для определения антигена.
Перед постановкой реакции лиофилизированные компоненты растворяют в объеме, указанном на этикетке 0,01 М раствором фосфатного буфера или дистиллированной водой и доводят до объема рабочих разведений. Объем каждого из компонентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, составляет 0,1 мл.
Этапы постановки реакции (рис. 70):
1. Сенсибилизация планшета. В лунки планшета вносят специфические антитела (иммуноглобулины) в рабочем разведении, указанном на этикетке.
Планшет с антителами инкубируют в термостате при 37°С 3 часа или при 4°С 18 часов. По окончании инкубации проводят отмывку планшета раствором фосфатного буфера, содержащим твин, 3-4 раза, предварительно встряхнув содержимое лунок. Остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.
2. Внесение антигенов. В лунки планшета, сенсибилизированные специфическими антителами, вносят контрольные положительный и отрицательный антигены и исследуемую пробу в разведениях от 1:10 до 1:1280 и инкубируют в термостате при 37°С 1 час. По истечении срока инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от несвязавшихся с антителом антигенов и подсушивают на фильтровальной бумаге.
3. Внесение пероксидазного антивидового конъюгата в разведении с целью выявления комплекса антиген+антитело. Залитые планшеты помещают в термостат при 37°С на 1 час. Затем лунки планшета трехкратно отмывают с раствором ФБТ и подсушивают.
4. Внесение субстратной смеси. Для проявления реакции в лунки планшета вносят раствор субстрата (индикатора пероксидазы) – ортофенилдиамина, к раствору которого добавляют 3%-ный раствор перекиси водорода для выявления комплекса антиген+антитело+конъюгат. Планшеты закрывают и оставляют в темном месте при комнатной температуре на 15-30 мин.
5. Учет реакции проводят визуально или спектрофотометрически.
Твердый субстрат (пластиковый микропланшет)
Рис. 70. Схема выявления антигена иммуноферментным методом.
Последовательность внесения компонентов:
1. Фиксация специфических антител на твердом субстрате.
2. Исследуемый антиген в разведениях.
3. Меченая ферментом антивидовая сыворотка.
4. Субстратная смесь (3%-ный раствор перекиси водорода с индикатором).
Положительная реакция: изменение цвета индикатора (оранжевое окрашивание).
При визуальной оценке реакции учет проводят по четырехплюсовой системе:
++++ - интенсивное окрашивание;
+++ - оранжевое окрашивание:
++ - бледно-оранжевое окрашивание;
+ - желтое окрашивание.
Пробу считают положительной при оценке в два плюса и более. За титр антигена принимают наивысшее разведение, при котором в реакции со специфическим антителом наблюдается бледно-оранжевое окрашивание (2+), значительно превосходящее по интенсивности окрашивание контрольных лунок планшета.
При спектрофотометрическом учете результатов реакции производят расчет коэффициента специфичности, который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным: антигеном (ОП1) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОП2). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности не ниже 2,1, и отрицательной, если ниже 2,1.
Техника постановки иммуноферментного метода для обнаружения (или титрования) антител выполняется так же, как при обнаружении и идентификации микробного антигена, с той разницей, что материалом является исследуемая сыворотка крови.
Задания для самостоятельной работы
1. Используя твердофазный иммуноферментный метод, провести определение вида антигена с диагностической целью.
2. Провести учет полученных результатов.
Вопросы для самоподготовки и контроля знаний
1. Какова сущность иммуноферментного метода и его отличие от других серологических реакций?
2. Какие компоненты участвуют в этой реакции и требования, предъявляемые к ним?
3. Техника постановки иммуноферментного метода и учет полученных результатов.
4. С какой целью используют иммуноферментный метод в микробиологии?
Тема 26. Использование в микробиологии полимеразной цепной реакции (пцр)
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Освоить сущность полимеразной цепной реакции, ознакомиться с компонентами и методом ее постановки.
МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Набор компонентов для постановки ПЦР, приборы - амплификатор, аппарат для электрофореза, трансиллюминатор.
ПЦР, разработанная в последние годы, находит все большее использование в микробиологии. С помощью этой реакции можно быстро и надежно провести диагностику инфекционных болезней животных и человека путем индикации возбудителя в исследуемом материале на генетическом уровне.
Вначале из патологического материала или микробной культуры методом щелочного гидролиза выделяют ДНК-образца. С ДНК-образца проводят полимеразную цепную реакцию, т.е. амплификацию заданного фрагмента ДНК-гена. При этом происходит образование дополнительных копий гена в пробирке заданного участка ДНК-образца. Для этого в пробирку с ДНК-образца вносят основные компоненты: праймер (затравку), трифосфаты, ДНК-полимеразу. Праймер представляет собой олигонуклеотид, состоящий из 15-20 нуклеотидов. Его получают путем химического синтеза на автоматическом синтезаторе «Виктория», пользуясь данными о первичной структуре (нуклеотидной последовательности) ДНК определенного вида микроорганизма.
Смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (dGTR, dATP, dCTP, dTTP) – дезоксигуанин, - аденин, цитозин, тимин, трифосфорная кислота. ДНК-полимераза - фермент, способный использовать полинуклеотиды как матрицы и строить комплиментарные им новые нуклеотидные цепи.
Пробирки помещают в амплификатор-прибор, который позволяет поддерживать строго заданный температурный режим, и осуществлять полимеразную цепную реакцию.
Сущность ПЦР заключается в том, что молекулу ДНК подвергают температурному плавлению, то есть нагреванию до 90-94°С, что ведет к денатурации – разрушению водородных связей между азотистыми основаниями двойной спирали, а затем охлаждают (отжиг) до 52°С в присутствии праймера, фермента ДНК-полимеразы и всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов. Последующее повышение температуры до 70-72°С приводит к синтезу новой молекулы ДНК, комплементарной матричной. Эту процедуру (плавления, отжига и синтеза ДНК) повторяют многократно, в результате чего количество выбранного фрагмента ДНК увеличивается.