Файл: Practicum_po_microbiologii.doc

Более точные результаты можно получить, применяя метод серийных разведений в жидкой среде. Бульон Хоттингера (или другую среду, пригодную для роста данного микроорганизма) разливают по 2 мл в пробирки, расставленные в штативы по 10 в каждом ряду. Готовят раствор антибиотика, содержащий 100 ЕД в 1 мл, и добавляют 2 мл этого раствора в первую пробирку. После тщательного перемешивания новой стерильной мерной пипеткой переносят 2 мл из этой пробирки в следующую и т.д. до девятой пробирки, из которой 2 мл выливают. Десятая пробирка, не содержащая антибиотика, служит контролем роста культуры. Для постановки этого опыта вместо стандартов антибиотиков можно с успехом использовать имеющиеся в продаже препараты, на этикетках которых указано количество единиц во флаконе. Например, если флакон содержит 500 000 ЕД пенициллина, то, добавив в него 10 мл дистиллированной воды, получают раствор, содержащий в 1 мл 50000 ЕД, при дальнейшем разведении в 100 раз получают раствор с концентрацией пенициллина 500 ЕД/мл. Для получения требуемой концентрации 100 ЕД/мл нужно развести этот раствор еще в 5 раз; это разведение делают при помощи бульона и 2 мл полученного раствора вносят в первую пробирку. Таким образом, в первой пробирке концентрация пенициллина 50 ЕД/мл, во второй 25 ЕД/мл и т.д. Если на этикетке препарата дозировка указана в весовых единицах, следует иметь в виду, что для большей части антибиотиков 1 г активного вещества соответствует 1 000 000 ЕД. Из этого расчета и следует разводить антибиотик.

Если порошок антибиотика расфасован не мерно и на этикетке указано количество единиц активности в 1 мг, необходимо к точной навеске препарата (20-25 мг), сделанной на аналитических весах, добавить равный объем растворителя, т.е. получить раствор мг/мл, в 1 мл которого содержится столько единиц, сколько их было указано па этикетке. Из этого основного раствора делают дальнейшие разведения по указанной выше схеме. Суточную агаровую культуру испытуемого микроба смывают изотоническим раствором хлорида натрия и, определив концентрацию взвеси по стандарту мутности, разводят до густоты 10 000 микробов в 1 мл. Полученную взвесь по 0,2 мл вносят во все пробирки ряда, начиная с контрольной. Таким образом, во всех пробирках определяют рост после инкубации при 37 °С в течение 18-20 ч. Последняя пробирка с прозрачным бульоном при наличии густого роста в контроле определяет минимальную концентрацию антибиотика, подавляющую рост данного микроорганизма.

Таблица 2

Критерии оценки чувствительности стафилококков к пенициллину

Чувствительные

Резистентные

Очень

чувствительные

Чувствительные

Умеренно

Чувствительные

Слабо

чувствительные

Резистентные

0,1 ед.

0,1-0,5 ед.

0,5 ед.

1-10 ед.

10 ед.

11.2. Метод диффузии в агар (метод бумажных дисков)

Наиболее прост и доступен метод определения чувствительности бактерий с помощью дисков, пропитанных антибиотиками. В стерильные чашки Петри, расположенные на горизонтальной поверхности, разливают по 15 мл МПА или другой питательной среды. Среда подсушивается в термостате и засевается исследуемым материалом методом «газона».

Для посева используют взвесь патологического материала (кал, молоко, гной, моча и др.) или выделенную чистую культуру возбудителя. Бактериальную взвесь равномерно распределяют по поверхности плотной питательной среды с помощью шпателя и чашки Петри, подсушивают вновь в термостате.

На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывают диски с антибиотиками – по 5-6 дисков на каждую чашку на расстоянии 25 мм от центра чашки. Чашки выдерживают в термостате при 37°С 16-18 ч, после чего учитывают результаты опыта путем измерения зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Размер зон зависит от степени чувствительности возбудителя к данному антибиотику. При зоне диаметром до 10 мм штамм расценивается как устойчивый, 11-15 мм - как малоустойчивый, 15-25 мм - как чувствительный. Зоны, превышающие 25 мм, свидетельствуют о высокой чувствительности микроорганизма к данному антибиотику (рис. 32).

Рис. 32. Метод диффузии в агар (метод бумажных дисков): определение чувствительности стафилококков – I – штамм 26, II – штамм 32; А – к пенициллину, Б – к стрептомицину, В – к неомицину

Задания для самостоятельной работы

1. Определить чувствительность выделенных чистых культур бактерий к антибиотикам методом диффузии в МПА.

2. Демонстрация посевов по определению чувствительности стафилококка к пенициллину методом серийных разведений в МПБ.

3. Полученные результаты внести в бланк экспертизы.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. Бактериостатическое действие антибиотиков проявляется в питательных средах:

А. В задержке роста бактерий.

Б. В гибели бактерий.

В. В стимуляции их роста.

2. В изучаемой культуре после добавления антибиотика наблюдалась задержка роста через 24 часа (МПБ прозрачный), при дальнейшем культивировании в пробирке появилось помутнение. Какое действие антибиотика проявилось?

А. Бактерицидное действие.

Б. Бактериостатическое действие.

3. При определении чувствительности культуры стафилококка к неомицину методом серийных разведений в МПБ приготовили рабочие разведения антибиотика:

1. 8 ЕД/мл; 2. 4 ЕД/мл; 3. 2 ЕД/мл; 4. 1 ЕД/мл;

5. 0,5 ЕД/мл; 6. 0,25 ЕД/мл; 7. 0,125 ЕД/мл.

После посева культуры и суточного роста установили отсутствие роста в первых четырех пробирках. Определите бактериостатическую дозу антибиотика:

А. 8.

Б. 4.

В. 2.

Г. 1.

Д. 0,5.

Е. 0,25.

Ж. 0,125 ЕД/мл.

4. При определении чувствительности бактерий к пенициллину методом диффузии в МПА установлено, что диаметр зоны задержки бактерий равен 8 мм. Какова степень чувствительности бактерий к антибиотику?

А. Устойчивые.

Б. Малочувствительные.

В. Чувствительные.

Г. Высокочувствительные.

5. При исследовании кала от больного колибактериозом теленка на чувствительность микрофлоры к антибиотикам методом диффузии в МПА установлено, что зона задержки роста бактерий с пенициллином составляла 8 мм, левомицетином – 23 мм, биомицином – 32 мм. Какой антибиотик может быть рекомендован для лечения?

А. Пенициллин.

Б. Левомицетин.

В. Биомицин.